Cel badania Analiza ma na celu określenie ilości kwasu homogentyzynowego (HGA) w wybranym materiale biologicznym, najczęściej w moczu, rzadziej w surowicy. Podwyższone stężenia HGA są charakterystycznym markerem alkaptonurii, wrodzonego defektu enzymatycznego w szlaku degradacji tyrozyny. Wskazania kliniczne Podejrzenie alkaptonurii – objawy skórne, ciemnienie moczu po utlenieniu, wczesne zmiany stawowe.
Diagnostyka różnicowa w niejasnych zaburzeniach metabolizmu tyrozyny i fenyloketonurii. Ocena przyczyn przewlekłego zapalenia stawów lub szybkiego postępu zwyrodnień w młodym wieku. Badania przesiewowe u dzieci i młodzieży z zaburzeniami neurorozwojowymi (w tym autyzmem), gdy istnieje podejrzenie dodatkowych nieprawidłowości metabolicznych. Kontrola terapeutyczna po potwierdzeniu alkaptonurii lub w ramach badań rodzinnych.
Materiał biologiczny Mocz – 10‑30 ml świeżego moczu, pobranego w pojemniku wolnym od dodatków, najlepiej w ciemnym szkle lub plastikowym pojemniku chronionym przed światłem. Surowica – 5‑10 ml krwi pobranej do probówki bez antykoagulantu, po odwirowaniu (w razie wskazań klinicznych).
Metoda analityczna Stężenie HGA wyznacza się najczęściej przy użyciu jednej z następujących technik: Chromatografia gazowa ze spektrometrią masową (GC‑MS) – zapewnia wysoką czułość i specyficzność. Chromatografia cieczowa wysokiej wydajności z detekcją UV lub fluorescencji (HPLC‑UV/FLD) – alternatywa o nieco niższej czułości, ale szeroko dostępna. Procedura obejmuje: Ekstrakcję HGA z próbki przy użyciu roztworu kwasu solnego lub metanolu.
Derivatyzację, najczęściej przy użyciu N‑metylo‑N‑(trimetylo‑silylo)trifluoroacetamidu, aby zwiększyć lotność związku w GC‑MS. Separację i kwantyfikację na podstawie krzywej kalibracyjnej przygotowanej z czystego kwasu homogentyzynowego. Kontrolę jakości poprzez wprowadzenie standardów wewnętrznych i zewnętrznych.
Przygotowanie pacjenta Aby uzyskać wiarygodny wynik, zaleca się: Unikanie pokarmów bogatych w tyrozynę i fenylalaninę przez co najmniej 12 godzin przed pobraniem próbki (jeśli to możliwe). Post trwający 8 godzin – woda jest dozwolona, natomiast napoje zawierające kofeinę i alkohol powinny być pominięte. Zbieranie moczu w czystym, nieprzezroczystym pojemniku, zabezpieczonym przed dostępem światła, aby zapobiec utlenianiu HGA.