Cel badania Badanie ma na celu identyfikację materiału genetycznego (DNA) grzybów z rodzaju Aspergillus w różnorodnych próbkach pobranych od pacjenta, wykorzystując podwójną amplifikację – metodę nested PCR. Dzięki podwójnemu zestawowi starterów uzyskuje się wyjątkowo wysoką czułość i specyficzność, co umożliwia wczesne wykrycie zarówno łagodnych, jak i ciężkich postaci aspergilozy.
Wskazania kliniczne Objawy sugerujące zakażenie grzybicze dróg oddechowych: przewlekły kaszel, duszność, gorączka, krwioplucie. Zmiany radiologiczne w płucach charakterystyczne dla aspergilozy (np. Pacjenci z osłabioną odpornością: poddawani chemioterapii, po przeszczepach, zakażeni HIV/AIDS, czy z wrodzonymi defektami immunologicznymi. Rozpoznanie alergicznej bronchopulmonalnej aspergilozy (ABPA) w połączeniu z testami immunologicznymi (np.
Ocena ryzyka infekcji grzybiczych u osób z zaburzeniami neurorozwojowymi, w tym autyzmem, u których obserwuje się zwiększoną podatność na przewlekłe infekcje. Materiał biologiczny Śluz i plwocina (sputum) – pobierane w warunkach aseptycznych. Wymaz z górnych dróg oddechowych (nosowo‑gardłowy, oskrzelowy). Próbki z płynu płucnego uzyskanego podczas bronchoskopii (BAL). Krew – surowica lub osocze, szczególnie przy podejrzeniu postaci inwazyjnej.
Biopsja tkankowa – w sytuacjach wymagających potwierdzenia inwazyjnej choroby. Przygotowanie pacjenta Wymagania przygotowawcze zależą od rodzaju pobieranej próbki: Próbki oddechowe: unikanie jedzenia i picia (poza wodą) przez minimum 30 min przed pobraniem, aby ograniczyć zanieczyszczenie bakteriami jamy ustnej. Krew: pobranie na czczo (co najmniej 8 godzinowy post) w celu minimalizacji wpływu lipidów i innych składników pożywienia na reakcję PCR.
Procedury inwazyjne (BAL, biopsja): wykonywane przez wykwalifikowany personel w warunkach sterylności, z zachowaniem standardowych protokołów antyseptycznych. Metoda badania Nested PCR (zagnieżdżona reakcja łańcuchowa polimerazy) składa się z dwóch kolejnych etapów amplifikacji: Etap pierwszy – zastosowanie zestawu zewnętrznych starterów, które amplifikują szeroki fragment regionu ITS (Internal Transcribed Spacer) lub 18S rRNA charakterystyczny dla całego rodzaju Aspergillus.
Etap drugi – użycie wewnętrznych starterów, które wzmacniają krótszy fragment znajdujący się w obrębie pierwszego produktu, co podnosi czułość (do kilku kopii DNA) i eliminuje niespecyficzne produkty. Po amplifikacji fragmenty DNA są wizualizowane metodą elektroforezy żelowej lub analizowane w czasie rzeczywistym (real‑time PCR) z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych. W razie potrzeby dodatkowymi testami może być potwierdzona sekwencja uzyskanego ampliconu.